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　　關(guān)于印發(fā)《醫(yī)院人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準操作程序》等技術(shù)規(guī)范的通知

　　關(guān)于印發(fā)《醫(yī)院人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準操作程序》等技術(shù)規(guī)范的通知

　　衛(wèi)辦醫(yī)政函〔2013〕402號

　　各省、自治區(qū)、直轄市衛(wèi)生廳局(衛(wèi)生計生委)，新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團衛(wèi)生局：

　　根據(jù)人感染H7N9禽流感疫情聯(lián)防聯(lián)控工作機制會議議定事項及《關(guān)于醫(yī)院開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測有關(guān)工作的通知》(衛(wèi)辦醫(yī)政函〔2013〕383號，以下簡稱《通知》)精神，為指導(dǎo)醫(yī)院做好人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測工作，我委組織制定了《醫(yī)院人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準操作程序》(附件1)，并委托中國疾控中心制定了《人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測實驗室生物安全保障基本要求》(附件2)等技術(shù)規(guī)范。現(xiàn)轉(zhuǎn)發(fā)給你們(可從國家衛(wèi)生和計劃生育委員會網(wǎng)站醫(yī)政管理欄目中下載)，供醫(yī)院在開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測時參考使用。

　　各省級衛(wèi)生(衛(wèi)生計生)行政部門要按照《通知》有關(guān)要求，組建省級疾控機構(gòu)實驗室和省級臨床檢驗專家共同組成的專家組，對醫(yī)院開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測工作提供技術(shù)指導(dǎo)和支持，負責(zé)醫(yī)院實驗室核酸檢測質(zhì)量控制工作。要組織本轄區(qū)人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測定點醫(yī)院檢驗人員進行培訓(xùn)，認真學(xué)習(xí)掌握相關(guān)要求，提高檢驗人員技術(shù)能力和水平。醫(yī)院開展病毒核酸檢測時，應(yīng)當按照技術(shù)規(guī)范有關(guān)要求，規(guī)范開展檢測工作，重視實驗室質(zhì)量控制，保障實驗室生物安全，做好檢驗人員職業(yè)防護，保證檢測結(jié)果科學(xué)、可靠。

　　附件：1.醫(yī)院人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準操作程序.docx

　　2.H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)說明書.docx

　　國家衛(wèi)生和計劃生育委員會辦公廳

　　2013年5月16日

　　醫(yī)院人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測標準操作程序

　　一、目的

　　確保人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測過程標準化、規(guī)范化，降低人為不規(guī)范操作對檢測結(jié)果造成的影響，保證結(jié)果的準確性和可重復(fù)性。

　　二、適用范圍

　　醫(yī)療機構(gòu)臨床基因擴增檢驗實驗室按照《關(guān)于醫(yī)院開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測有關(guān)工作的通知》(衛(wèi)辦醫(yī)政函〔2013〕383號)和《關(guān)于做好醫(yī)療機構(gòu)人感染H7N9禽流感檢測試劑供給保障工作的通知》(衛(wèi)發(fā)明電〔2013〕29號)有關(guān)要求，使用國家疾病預(yù)防控制中心制備或商品化試劑盒開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測工作。

　　三、樣本采集、運送和保存

　　盡量采集病例發(fā)病早期的呼吸道樣本(上呼吸道樣本包括咽拭子、鼻拭子、鼻咽抽取物、咽漱液和鼻洗液, 下呼吸道樣本包括痰液、氣管吸取物、肺洗液、肺組織等)。可將鼻、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高檢出率。患者有下呼吸道樣本時，應(yīng)優(yōu)先采集。

　　根據(jù)試劑說明書對樣本采集方法有關(guān)要求，制訂樣本采集標準操作程序(SOP)，并組織樣本采集人員進行培訓(xùn)及考核。樣本的采集應(yīng)當嚴格按照SOP進行。

　　樣本采集后，按照《人間傳染病的病原微生物名錄》中高致病性禽流感病毒的相關(guān)規(guī)定進行包裝，用密封容器立即送往實驗室。若氣溫高時，需放入冰塊降溫。樣本抵達實驗室后，應(yīng)盡快進行檢測，24小時內(nèi)能檢測的樣本可置于2～8℃暫時保存，24小時內(nèi)無法檢測的樣本則應(yīng)置于≤-70℃狀態(tài)保存。如無-70℃保存條件時，可于-20℃冰箱暫存。樣本避免反復(fù)凍融。

　　樣本采集、處理、運輸及保存不當時，可因病毒RNA降解出現(xiàn)假陰性結(jié)果，也可因為樣本“污染”出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

　　四、PCR檢測

　　(一)樣本處理

　　樣本的核酸提取應(yīng)當在樣本處理區(qū)進行。按所采用的商品化試劑盒說明書要求，取適量待檢樣本、陽性及陰性對照進行核酸提取。樣本應(yīng)盡可能新鮮，提取過程應(yīng)嚴防RNA酶污染及操作不當導(dǎo)致的RNA降解。提取過程如涉及離心步驟，應(yīng)采用低溫冷凍離心機;在生物安全柜內(nèi)進行加樣、提取過程中，為防止RNA降解，可將試管架置于托盤內(nèi)平鋪的碎冰上。提取好的RNA應(yīng)及時用于檢測，否則應(yīng)當-70℃保存。如無-70℃保存條件，可于-20℃冰箱暫存。

　　(二)試劑準備

　　試劑準備應(yīng)當在試劑準備區(qū)進行。根據(jù)所用的試劑盒，樣本可進行甲型流感病毒核酸、禽流感H7亞型或H7N9病毒核酸的檢測。試劑的配制按所用商品化試劑盒說明書進行。除酶混合物外，其它試劑在使用前應(yīng)當在室溫充分復(fù)融，混勻并瞬時低速離心。反應(yīng)液分裝時盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機前注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免管內(nèi)溶液泄露污染儀器。分裝有擴增反應(yīng)液的反應(yīng)管應(yīng)當扣蓋或裝入密實袋內(nèi)再轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。

　　(三)加樣

　　加樣應(yīng)當在樣本處理區(qū)進行。加樣時應(yīng)當使樣品完全落入反應(yīng)液中，不應(yīng)有樣品粘附于管壁上，加樣后應(yīng)盡快蓋緊管蓋。

　　按試劑、儀器說明書完成加樣和PCR反應(yīng)管準備。

　　(四)PCR擴增檢測

　　PCR擴增檢測在擴增區(qū)進行。待檢PCR管轉(zhuǎn)移至擴增區(qū)，按順序置于PCR儀上，編輯樣本信息，按試劑和儀器說明書設(shè)定循環(huán)參數(shù)。

　　(五)結(jié)果分析

　　根據(jù)所用試劑盒說明書設(shè)置基線值(baseline)。熒光閾值(threshold)設(shè)定以閾值線剛好超過陰性對照品擴增曲線(無規(guī)則的噪音線)的最高點為原則，且Ct值應(yīng)大于所設(shè)置的擴增循環(huán)數(shù)(或顯示為undet)。使用儀器配套軟件自動分析結(jié)果。

　　(六)質(zhì)量控制

　　檢測過程對可能出現(xiàn)的假陽性和假陰性進行質(zhì)量控制，除了檢測商品試劑盒所提供陽性和陰性對照外，每次臨床樣本檢測時，至少應(yīng)當有1份弱陽性和3份陰性質(zhì)控樣本(多份陰性質(zhì)控樣本設(shè)置對實驗室“污染”所致假陽性的監(jiān)控更為有效)，隨機放在所檢測標本的中間。弱陽性質(zhì)控樣本可為檢測陽性的滅活稀釋后保存的臨床樣本、滅活病毒或假病毒顆粒等，如所采用的商品化試劑盒有“內(nèi)標”控制假陰性，或弱陽性質(zhì)控樣本來源困難，可暫不設(shè)弱陽性質(zhì)控。陰性質(zhì)控樣本采用標本采集管內(nèi)溶液即可。質(zhì)控樣本應(yīng)與臨床標本同等對待，參與樣本核酸提取和擴增檢測全過程。

　　試劑盒中的陽性和陰性對照用于判斷實驗室的有效性，按試劑盒說明書進行。

　　(七)實驗結(jié)果的判定與解釋。

　　按照試劑盒說明書進行。對于出現(xiàn)弱陽性結(jié)果的樣本應(yīng)進行重復(fù)檢測，并注意與可能的實驗室輕度或樣本交叉“污染”所致假陽性結(jié)果區(qū)別。

　　五、檢測結(jié)果報告

　　按照試劑盒說明書進行。

　　六、其它注意事項

　　(一)人感染H7N9禽流感病毒實驗室活動、樣本采集和運輸按照《人間傳染的病原微生物名錄》中高致病性禽流感病毒進行管理。從事人感染禽流感檢測的技術(shù)人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)并具備相應(yīng)的實驗技能，在檢測過程中必須采取生物安全防護措施(使用眼罩、N95型口罩等)。樣本核酸提取必須在Ⅱ級生物安全實驗室，經(jīng)過年檢合格的二級生物安全柜內(nèi)進行。實驗室應(yīng)具有良好的通風(fēng)。

　　(二)注意儀器設(shè)備的日常和定期維護，加樣器、擴增儀和溫育設(shè)備應(yīng)進行定期校準。試劑盒及一次性使用的無DNA酶和RNA酶PCR反應(yīng)管、離心管、帶濾芯吸頭等應(yīng)進行每批質(zhì)檢。

　　(三)實驗應(yīng)嚴格分區(qū)操作;各區(qū)物品、工作服等均應(yīng)當專區(qū)專用，不得交叉使用。實驗后應(yīng)及時清潔工作臺，以防污染。

　　(四)每批實驗室后，可采取實驗室通風(fēng)、10%次氯酸鈉溶液擦洗地臺面、紫外照射等措施，消除可能存在的擴增產(chǎn)物氣溶膠污染。

　　(五)使用中國疾控中心制備試劑開展檢測工作時，可參考相應(yīng)試劑盒說明書(見附件1、2)有關(guān)要求。

　　附件：1.H7N9亞型禽流感病毒RNA檢測試劑盒(熒光PCR法)說明書

　　2.H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)說明書

　　H7N9亞型禽流感病毒RNA檢測試劑盒(熒光PCR法)說明書

　　【產(chǎn)品名稱】

　　通用名稱：H7N9亞型禽流感病毒RNA檢測試劑盒(熒光PCR法)

　　英文名稱：Diagnostic Kit for H7N9 subtype avian flu virus RNA(Fluorescence PCR)

　　【包裝規(guī)格】48人份/盒。

　　【預(yù)期用途】

　　本試劑用于對咽拭子樣本中H7N9亞型禽流感病毒RNA進行定性檢測，用于H7N9禽流感病毒感染的輔助診斷及流行病學(xué)監(jiān)控。

　　【檢驗原理】根據(jù)熒光PCR技術(shù)原理，針對H7N9亞型禽流感病毒的HA基因和NA基因設(shè)計特異性引物和Taqman探針，通過熒光PCR檢測儀進行檢測，從而實現(xiàn)對H7N9亞型禽流感病毒RNA的定性檢測。試劑盒以正常人上皮細胞中廣泛存在的核糖核酸酶P(RNase P)的mRNA為正常人體細胞對照，對提取和檢測過程進行監(jiān)控。

　　【主要組成成分】

　　名稱 成分 　　規(guī)格 數(shù)量(管)

　　H7反應(yīng)液 　　含內(nèi)標RNP 、H7亞型特異基因的引物探針混合液 1.0ml/管 1

　　N9反應(yīng)液 　　含內(nèi)標RNP 、N9亞型特異基因的引物探針混合液 1.0ml/管 1

　　DNA聚合酶 　　DNA聚合酶，不可用其他同類DNA聚合酶替代 60μl /管 1

　　逆轉(zhuǎn)錄酶 　　逆轉(zhuǎn)錄酶，不可用其他同類逆轉(zhuǎn)錄酶替代 60μl /管 1

　　陽性對照 　　RNP、H7、N9 RNA假病毒混合物 1.0ml/管 1

　　陰性對照 　　DEPC水 1.0ml/管 1

　　本品各組成成分均不得與其他產(chǎn)品或不同批號產(chǎn)品中的相應(yīng)組成成分進行互換。

　　本品不包含，但對試驗必須的設(shè)備和試劑：

　　生物安全柜、臺式離心機、旋渦震蕩器、拭子、采樣管、無菌病毒采樣液、1.5 ml無核酸酶的離心管、全自動熒光PCR檢測儀專用PCR擴增管和核酸分離試劑盒(硅膠膜吸附法，北京金豪制藥股份有限公司，Cat：BJH101)。

　　【儲存條件及有效期】-20℃冷凍保存，有效期2個月，陽性對照反復(fù)凍融次數(shù)不得超過5次。

　　【適用儀器】RG3000、LightCycler、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自動熒光PCR檢測儀。

　　【樣本要求】

　　1. 樣本類型：咽拭子。推薦使用金豪公司生產(chǎn)的微生物采樣及運送管(12人份/盒)。

　　2. 拭子、采樣管和保存液：

　　2.1拭子選擇：應(yīng)使用頭部為合成纖維(例如，聚酯纖維)，桿部為鋁或塑料的拭子。

　　2.2采樣管：外螺旋口、耐-70℃凍存，可容納3 ml病毒采樣液。

　　2.3無菌病毒采樣液：應(yīng)含有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，阻止細菌和真菌生產(chǎn)的抗生素，緩沖液，經(jīng)無菌處理。

　　3.樣本采集、運輸和保存：

　　由于H7N9亞型禽流感病毒為呼吸道傳播病毒，有關(guān)生物安全應(yīng)按照“《人間傳染的病原微生物名錄》”中高致病性禽流感病毒進行管理。

　　3.1采集：采集病人發(fā)病3日內(nèi)的咽拭子標本，用于病原檢測。用微生物采樣及運送管內(nèi)的采樣棉簽，適度用力拭抹咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，應(yīng)避免觸及舌部;迅速將棉簽放入裝有3ml保存液的15ml外螺旋蓋采樣管中，在靠近頂端處折斷棉簽桿，旋緊管蓋并密封，以防干燥，外表貼上帶有唯一識別號碼的標簽。4℃暫存并在48小時內(nèi)送達實驗室。

　　3.2保存和運輸：新鮮采集樣本應(yīng)在4℃條件下48小時運送到檢測實驗室。保存樣本可在-20℃以下低溫冷凍保藏，需長期保存的標本存于-70℃冰箱。冷凍樣本應(yīng)在冷凍條件下送至實驗室。運輸時在包裝箱內(nèi)填充吸水材料，運輸過程中保持標本采集管直立狀態(tài)，不能傾斜。

　　樣本送至實驗室后，立即進行處理和分裝，避免反復(fù)凍融。臨床樣本保存在4℃不能超過4天。

　　4.咽拭子標本的處理

　　咽拭子要在標本保存液中充分攪動(至少 40 下)，以洗脫拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，用于病毒分離時，需要凍融一次(防止多次凍融)，使細胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4℃條件下，10000rpm離心20分鐘，用上清接種細胞或直接提取RNA。如果發(fā)現(xiàn)有細菌污染，須用濾器過濾除菌。

　　【檢驗方法】

　　1. 核酸提取：

　　取200μl咽拭子樣本進行核酸提取。采用北京金豪制藥股份有限公司的核酸分離試劑盒 (硅膠膜吸附法)，該試劑盒可用于對呼吸道懸浮液樣本中的病毒RNA提取，并按試劑盒說明書要求操作。

　　本品的陽性對照和陰性對照均參與核酸提取。

　　1.1. 準備及注意事項：

　　1.1.1 分別在洗液A瓶和洗液B瓶中加入16ml和60ml無水乙醇，顛倒充分混勻，并在瓶身上加以標識。

　　1.1.2 吸取所需的洗脫液，加至一無核酸酶的eppendorf管中，于70℃預(yù)熱。

　　1.1.3 冷凍樣本應(yīng)室溫融化，輕微震蕩混勻后使用。

　　1.1.4 區(qū)分操作中的離心設(shè)置(rpm和g)，本產(chǎn)品操作過程均為室溫離心。

　　1.1.5 助沉劑在低溫保存時可能呈膠狀，吹打混勻即可使用。

　　1.2. 樣本裂解及核酸吸附

　　1.2.1 在1.5ml無核酸酶的離心管中加入10μl助沉劑和400μl裂解液，加入200μl待處理樣本，劇烈震蕩2分鐘，室溫靜置10分鐘。

　　注：如樣本體積小于或大于200μl，需按比例改變助沉劑、裂解液以及無水乙醇體積。體積大于400μl樣本應(yīng)分多次進行處理。

　　1.2.2 加入480μl無水乙醇，顛倒混勻，吸取600μl裂解混合物轉(zhuǎn)移到核酸吸附柱中。

　　注：如樣本體積小于或大于200μl，需按比例改變乙醇用量。

　　1.2.3 3500g離心2分鐘，取下套管，倒掉套管中的液體。將剩余裂解混合物轉(zhuǎn)移至核酸吸附柱，重新離心一次，棄套管中的液體。

　　1.2.4 將核酸吸附柱重新裝入套管，6000g離心1分鐘，倒掉套管中的液體。

　　1.3. 核酸純化

　　1.3.1 將核酸吸附柱重新裝入套管，在核酸吸附柱中加入500μl洗液A，6000g離心1分鐘，將核酸吸附柱裝入一個干凈套管中。

　　1.3.2 在核酸吸附柱中加入500μl洗液B，靜置1分鐘，6000g離心1分鐘。

　　1.3.3 倒掉套管中的液體，將核酸吸附柱重新裝入套管。

　　1.3.4 重復(fù)一次1.3.2步驟(本步驟不用靜置1分鐘)。

　　1.3.5 將核酸吸附柱換一新套管，13000rpm離心3分鐘。

　　1.4. 核酸洗脫

　　1.4.1 將核酸吸附柱裝入一無核酸酶1.5ml離心管，小心在吸附膜中央加入50μl預(yù)熱洗脫液，室溫靜置4分鐘。

　　1.4.2 10000 rpm離心2分鐘，離心管中液體即待測樣本RNA。

　　2. PCR擴增：

　　2.1 實驗設(shè)計：

　　2.1.1待檢樣本檢測：每份樣本分別使用2種反應(yīng)液(H7和N9反應(yīng)液)進行檢測，綜合2種反應(yīng)液的檢測結(jié)果對樣本進行判定。

　　2.1.2對照品檢測：每次試驗都應(yīng)設(shè)置陰性對照和陽性對照。

　　2.2反應(yīng)體系的配制：

　　2.2.1準備工作：將2種反應(yīng)液(H7和N9反應(yīng)液)融化后振蕩混勻，離心6000rpm 10秒。

　　2.2.2 2種反應(yīng)體系(H7和N9)的配制：取2個1.5ml 無核酸酶離心管，計算待測樣本數(shù)量(n)，分別取20μl×(n+2)反應(yīng)液(H7和N9)、0.5μl×(n+2)DNA聚合酶和0.5μl×(n+2)逆轉(zhuǎn)錄酶充分混勻，離心6000rpm 10秒。

　　n + 2 = n份樣本+1份陽性對照+1份陰性對照;

　　2.3反應(yīng)體系分管：

　　每份待測樣本設(shè)置2個PCR擴增管(H7和N9)，分別將每種反應(yīng)體系按20μl/管分裝至對應(yīng)的PCR擴增管中。

　　2.4加樣：

　　每份待測樣本RNA、陽性對照、陰性對照以5μl/管分別加入2個PCR擴增管中。

　　2.5擴增檢測：

　　將加樣后的PCR擴增管分別轉(zhuǎn)移到全自動熒光定量PCR檢測儀上進行擴增檢測，不同儀器的設(shè)置如下：

　　2.5.1全自動熒光定量PCR檢測儀(RG3000、ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型)擴增程序：

　　對于ABI Prism 7500、ABI Prism 7000型全自動熒光定量PCR檢測儀，熒光信號設(shè)置為：Reporter Dye1：FAM、JOE/VIC，Quencher Dye1：NONE，Passive Reference：NONE。其他型號儀器可設(shè)置為FAM和HEX通道。熒光PCR擴增程序的設(shè)置見表1。反應(yīng)總體積為25μl。

　　表1.熒光PCR擴增程序

　　步驟 　反應(yīng)溫度 　　時間 是否采集光 循環(huán)數(shù)

　　逆轉(zhuǎn)錄及變性 　50℃ 　30分鐘 　　否 　　1

　　95℃ 　3分鐘 　　否

　　預(yù)擴增 　95℃ 　15秒 　　否 　　5

　　50℃ 　30秒 　　否

　　72℃ 　1分鐘 　　否

　　擴增及熒光收集 　95℃ 　10秒 　　否 　　40

　　55℃ 　40秒 　　是

　　2.5.2 全自動熒光定量PCR儀(Roche LightCycler系列)擴增程序：

　　選擇FAM、HEX通道收集熒光。熒光PCR擴增程序見表2。

　　表2.熒光PCR擴增程序

　　步驟 反應(yīng)溫度 　　時間 是否采集熒光 循環(huán)數(shù)

　　逆轉(zhuǎn)錄及變性 50℃ 　　30分鐘 　　否 　　1

　　93℃ 　　3分鐘 　　否

　　預(yù)擴增 93℃ 　　15秒 　　否 　　5

　　50℃ 　　30秒 　　否

　　72℃ 　　1分鐘 　　否

　　擴增及熒光收集 93℃ 　　10秒 　　否 　　40

　　55℃ 　　40秒 　　是

　　3. 結(jié)果分析：

　　3.1本品H7熒光探針的報告熒光為FAM，N9熒光探針的報告熒光為FAM，RNP熒光探針的報告熒光為HEX。所以應(yīng)選擇FAM通道和HEX通道分析試驗結(jié)果。

　　3.2 基線(Baseline)范圍根據(jù)儀器要求設(shè)定，目的為校正背景熒光干擾，終止循環(huán)(End)一般設(shè)置為最強樣本出現(xiàn)擴增信號的前3-4個循環(huán)。

　　3.3 閾值線用于判斷樣本是否擴增，應(yīng)調(diào)整使閾值線高于熒光背景和陰性對照的熒光信號，或點擊分析(Analysis)自動獲得。

　　4. 質(zhì)量控制：

　　每次試驗應(yīng)設(shè)置陽性對照和陰性對照，且應(yīng)符合以下要求，否則試驗結(jié)果不成立。

　　4.1陰性對照無Ct值或Ct值為0。

　　4.2 陽性對照Ct值小于30.0。

　　【參考值(參考范圍)】

　　Ct值≤37.0報告該反應(yīng)陽性;

　　無Ct值或Ct值為0報告該反應(yīng)陰性;

　　37.0

　　內(nèi)標RNP有效的范圍為：0

　　【檢驗結(jié)果的解釋】

　　1. 在內(nèi)標RNP結(jié)果成立的條件下各種判讀模式如下：

　　反應(yīng)液 模式1 模式2 模式3 模式4

　　H7 - - + +

　　N9 - + - +

　　RNP + + + +

　　結(jié)果判斷 H7N9亞型禽流感病毒RNA陰性 H7N9亞型禽流感病毒RNA陰性 H7N9亞型禽流感病毒RNA陰性 H7N9亞型禽流感病毒RNA陽性

　　注：在內(nèi)標RNP結(jié)果不成立的條件下視為檢測異常，應(yīng)重新采樣檢測。

　　2. 結(jié)果在灰區(qū)的樣本需重復(fù)試驗：取200μl樣本重新提取RNA(核酸分離試劑盒中裂解液、無水乙醇的用量加倍，其他組分的用量不變)并檢測。復(fù)檢結(jié)果Ct<40.0的樣本為陽性，否則為陰性。

　　3. 內(nèi)標RNP檢測靶物質(zhì)為正常人上皮細胞中廣泛存在的核糖核酸酶P(RNase P)的mRNA，用于對樣本中RNA的提取和擴增檢測過程進行有效監(jiān)控。

　　如果該份樣本的RNP檢測 Ct值≥33.0，可能為以下原因：

　　3.1 未采集到足夠的正常人上皮細胞，應(yīng)重新采樣。

　　3.2核酸提取過程異常，導(dǎo)致RNA損失，應(yīng)重新提取。

　　3.3樣本中存在RT-PCR抑制物質(zhì)，可稀釋后檢測;

　　【檢驗方法的局限性】

　　1.樣本中RNA濃度低于本產(chǎn)品的最低檢出值(100copies/ml)時可能出現(xiàn)假陰性。

　　2.目前研究顯示，發(fā)病后兩日內(nèi)取樣檢測，病毒RNA檢出率最高，隨發(fā)病時間的延長，病毒被清除，病毒核酸的檢出水平迅速下降。因此應(yīng)在發(fā)病后盡早采樣，必要時可采用多部位取樣檢測。臨床評價應(yīng)結(jié)合其他臨床癥狀和實驗室檢測指標進行判斷。

　　【產(chǎn)品性能指標】

　　1.本品可最低檢出100copies/ml稀釋物。

　　2.本品對季節(jié)性流感(H1N1以及H3N2)滅活病毒、B型流感滅活病毒、高致病性禽流感滅活病毒(H5N1)RNA進行檢測，結(jié)果為陰性。

　　【注意事項】

　　1.開始檢測前請仔細閱讀本說明書全文，并嚴格按照要求進行操作。

　　2.實驗室配置和試驗操作請按照《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》和《臨床基因擴增檢驗實驗室工作規(guī)范》進行;整個檢測過程應(yīng)嚴格分區(qū)進行：PCR反應(yīng)體系的配置區(qū);標本處理、加樣區(qū);各區(qū)使用的儀器、設(shè)備、耗材和工作服應(yīng)獨立專用。

　　3.H7N9亞型禽流感為經(jīng)呼吸道傳播疾病，應(yīng)按照相關(guān)要求進行。樣本的采集、處理、運輸和保存均存在一定生物危害。樣本的采集、運輸和保存應(yīng)按照乙類傳染病進行管理;標本的提取必須在生物安全二級實驗室的負壓生物安全柜中完成;試驗中接觸過標準品和對照品的廢棄物品(如吸頭)、擴增完畢的離心管、標本等應(yīng)進行無害化處理后方可丟棄。

　　4.不同批號的試劑請勿混用，請在有效期內(nèi)使用試劑盒。

　　5. 本產(chǎn)品僅用于體外診斷檢測。

　　【參考文獻】

　　1. 微生物和生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準則(WS 233-2002)

　　2.《人感染H7N9禽流感診療方案(2013年第2版)》

　　3.《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》(衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號)

　　【生產(chǎn)企業(yè)】

　　企業(yè)名稱：北京金豪制藥股份有限公司

　　生產(chǎn)地址：北京市北京經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)運成街7號

　　注冊地址：北京市北京經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)運成街7號1號樓

　　郵政編碼：100176

　　電話號碼：010-67878866

　　傳真號碼：010-67881632

　　網(wǎng) 址：www.kinghawk828.com

　　【醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)許可證編號】京藥監(jiān)械生產(chǎn)許20050017號

　　H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒

　　(PCR-熒光探針法)說明書

　　【產(chǎn)品名稱】通用名稱：H7N9禽流感病毒核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法)

　　英文名稱：Detection Kit for Avian Influenza Virus Subtype H7N9 RNA (PCR-Fluorescence Probing)

　　【包裝規(guī)格】大包裝，48反應(yīng)/盒

　　【預(yù)期用途】

　　流感病毒可分為甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。其中，甲型流感依據(jù)流感病毒血凝素蛋白(HA)的不同可分為1-16種亞型，根據(jù)病毒神經(jīng)氨酸酶蛋白(NA)的不同可分為1-9種亞型，HA不同亞型可以與NA的不同亞型相互組合形成不同的流感病毒。而禽類特別是水禽是所有這些流感病毒的自然宿主，H7N9禽流感病毒是其中的一種。H7N9流感病毒既可以感染禽類，也可以感染人。人感染H7N9禽流感會出現(xiàn)嚴重肺炎，癥狀包括發(fā)燒、咳嗽、呼吸困難等。

　　本試劑盒適用于檢測呼吸道樣本、血清、肺組織等樣本中H7N9禽流感病毒RNA，可用于該病毒感染的實驗室診斷和宿主動物的監(jiān)控。檢測結(jié)果僅供研究，不用于臨床診斷。

　　【檢驗原理】

　　本試劑盒基于實時熒光PCR技術(shù)，分別選取H7N9禽流感病毒的HA基因和NA基因保守區(qū)作為擴增靶區(qū)域，設(shè)計特異性引物探針，通過一步法實時熒光PCR體系擴增對H7N9禽流感病毒進行定性檢測。反應(yīng)體系中除特異性引物和特異性熒光探針外，還配以對應(yīng)的PCR反應(yīng)Buffer、逆轉(zhuǎn)錄酶、Hot-Start Taq酶、核苷酸單體(dNTPs)、Mg2+等成分，可實現(xiàn)對H7N9禽流感病毒核酸靈敏特異地檢測。

　　【主要組成成分】

　　組分名稱 規(guī)格 數(shù)量

　　PCR檢測試劑 AIV H7 PCR反應(yīng)液A 816μl/管 1

　　AIV N9 PCR反應(yīng)液A 816μl/管 1

　　AIV H7N9 PCR反應(yīng)液B 288μl/管 1

　　AIV H7N9內(nèi)標溶液 240μl/管 1

　　質(zhì)控品 陰性質(zhì)控品 200μl/管 1

　　AIV H7N9陽性質(zhì)控品 200μl/管 1

　　【儲存條件及有效期】保存于-20±5℃，反復(fù)凍融次數(shù)<5次，有效期9個月。

　　【適用儀器】ABI 7500、ABI 7300、LightCycler480等熒光定量PCR儀。

　　【樣本要求】

　　1 適用樣本類型：呼吸道樣本、血清、肺組織。

　　2 樣品采集、保存與運送。

　　標本采集、保存、運送請遵循《人感染H7N9禽流感病毒標本采集及實驗室檢測策略》。

　　【檢驗方法】

　　1.核酸提取

　　建議取200μl液態(tài)樣本進行核酸提取;組織樣本可以研磨液進行提取操作。可采用中山大學(xué)達安基因股份有限公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒，請按照試劑盒說明書進行操作;也可選擇其他合適的商業(yè)化產(chǎn)品。本試劑盒中的內(nèi)標溶液參與提取過程，若提取試劑盒中未說明內(nèi)標的使用方法可在每200μl樣本中加入4μl內(nèi)標溶液后進行核酸提取。

　　本試劑盒中的陰性質(zhì)控品參與提取，用于對環(huán)境進行監(jiān)控;AIV H7N9陽性質(zhì)控品不參與提取，用于PCR檢測試劑的質(zhì)控。

　　2.PCR擴增(ABI 7500儀器操作為例，ABI 7300、LC480等儀器參照此操作及儀器操作手冊)

　　2.1分別配制AIV H7 RT-PCR反應(yīng)體系和AIV N9 RT-PCR反應(yīng)體系

　　2.1.1 AIV H7 RT-PCR反應(yīng)體系配制

　　取適量PCR反應(yīng)管(按AIV H7反應(yīng)體系計算);每管加入AIV H7 PCR反應(yīng)液A 17μl、AIV H7N9 PCR反應(yīng)液B 3μl(也可按照單個反應(yīng)的用量，計算PCR反應(yīng)液A、B各自所需總量，兩者混勻后分裝20μl于單個PCR反應(yīng)管中)。

　　2.1.2 AIV N9 RT-PCR反應(yīng)體系配制

　　取適量PCR反應(yīng)管(按AIV N9反應(yīng)體系計算);每管加入AIV N9 PCR反應(yīng)液A 17μl、AIV H7N9 PCR反應(yīng)液B 3μl(也可按照單個反應(yīng)的用量，計算PCR反應(yīng)液A、B各自所需總量，兩者混勻后分裝20μl于單個PCR反應(yīng)管中)。

　　2.2 于上述PCR反應(yīng)管中分別加入處理后的陰性質(zhì)控品、AIV H7N9陽性質(zhì)控品、待測標本核酸各5μl，8,000rpm離心數(shù)秒，放入PCR擴增儀。

　　2.3探針檢測模式設(shè)置為：Reporter Dye1：FAM，Quencher Dye：NONE，Reporter Dye2：Vic，Quencher Dye2：NONE， Passive Reference：NONE。反應(yīng)條件設(shè)置為：50℃ 15min，1個循環(huán);95℃ 15分鐘，1個循環(huán);94℃ 15秒→58℃ 45秒(收集熒光)，45個循環(huán)。保存文件，運行。

　　3.結(jié)果分析

　　3.1 反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。

　　3.2 分析條件設(shè)置：根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)Baseline的start值、stop值以及Threshold的Value值(用戶可根據(jù)實際情況自行調(diào)整，Start值可以在3～15、End值可設(shè)在5～20，調(diào)整陰性對照的擴增曲線平直或低于閾值線)，點擊Analysis自動獲得分析結(jié)果，在Report界面察看結(jié)果。

　　【質(zhì)量控制】

　　陰性質(zhì)控品：FAM檢測通路擴增曲線無對數(shù)增長期，VIC檢測通路擴增曲線為明顯對數(shù)增長期;

　　陽性質(zhì)控品：FAM檢測通路擴增曲線有明顯對數(shù)增長期，且FAM檢測通道擴增曲線 Ct值≤32;

　　以上要求需在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。

　　【結(jié)果判定】

　　1.如果檢測樣品的AIV H7及N9 RT-PCR反應(yīng)體系FAM檢測通道均無擴增曲線或Ct值>40，且在VIC檢測通道均有對數(shù)增長期，可判樣品為H7N9禽流感病毒陰性;

　　2.如果檢測樣品的AIV H7及N9 RT-PCR反應(yīng)體系擴增曲線在FAM,VIC檢測通道均有對數(shù)增長期且FAM檢測通道Ct值≤40;可判樣品為H7N9禽流感病毒陽性;

　　3.如果檢測樣品的AIV H7或N9 RT-PCR反應(yīng)體系僅其中之一的擴增曲線滿足判為陽性的要求，則需重復(fù)檢測;若重復(fù)檢測結(jié)果為H7及N9均陽性，則判H7N9禽流感病毒陽性;若重復(fù)檢測結(jié)果仍為H7(或N9)陽性，則只能判禽流感病毒H7(或N9)亞型陽性，并建議以其他方法做進一步確認。

　　【檢測方法的局限性】

　　1.樣本檢測結(jié)果與樣本收集、處理、運送及保存質(zhì)量有關(guān)。

　　2.樣本處理時沒有控制好交叉污染，可能出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

　　3.病毒在流行過程中的基因突變則也可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果。

　　4.由于不同提取方法的原理不同，采用不同核酸提取試劑進行樣本處理時核酸提取效率存在一定差異，本試劑盒推薦使用本公司生產(chǎn)的核酸提取試劑盒(離心柱法)，用戶可根據(jù)具體要求進行選擇確認。

　　5.本檢測結(jié)果僅供臨床參考，如需確診病例請結(jié)合臨床癥狀及其他檢測手段.

　　【產(chǎn)品性能指標】

　　根據(jù)產(chǎn)品分析性能評估結(jié)果，本試劑盒的分析靈敏度為1.0×103copies/ml。與感染部位相同或感染癥狀相似的其他病原體(甲型流感病毒H3亞型、甲型流感病毒H1亞型、乙型流感病毒、副流感病毒、禽流感H5亞型病毒、禽流感H9亞型病毒等)無交叉反應(yīng)。

　　【注意事項】

　　1.實驗室管理應(yīng)嚴格按照PCR基因擴增實驗室的管理規(guī)范，實驗人員必須進行專業(yè)培訓(xùn)，實驗過程嚴格分區(qū)進行(試劑準備區(qū)、標本制備區(qū)、擴增和產(chǎn)物分析區(qū))，所用消耗品應(yīng)滅菌后一次性使用，實驗操作的每個階段使用專用的儀器和設(shè)備，各區(qū)各階段用品不能交叉使用;

　　2.為試劑和標本準備階段提供生物安全柜，實驗過程中穿工作服，帶一次性手套，使用自卸管移液器;

　　3.試劑使用前要完全解凍，8,000rpm離心數(shù)秒后使用;

　　4.標本制備區(qū)所用過的吸頭請打入盛有消毒劑的容器，并與廢棄物一起滅菌后方可丟棄;

　　5.實驗完畢用10%次氯酸或75%酒精或紫外線燈處理工作臺和移液器;

　　6.本試劑盒內(nèi)陽性質(zhì)控品應(yīng)視為具有傳染性物質(zhì)，操作和處理均需符合相關(guān)法規(guī)要求：衛(wèi)生部《微生物生物醫(yī)學(xué)實驗室生物安全通用準則》和《醫(yī)療廢物管理條例》。

　　【生產(chǎn)企業(yè)】企業(yè)名稱：中山大學(xué)達安基因股份有限公司

　　生產(chǎn)地址：廣州市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)香山路19號;廣州市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)荔枝山路6號

　　郵 編：510665

　　電 話：020-32290789、8008304008

　　傳 真：020-32068820

　　網(wǎng) 址：http://www.daangene.com

　　【醫(yī)療器械生產(chǎn)企業(yè)許可證編號】粵食藥監(jiān)械生產(chǎn)許20040999號

　　附件2

　　人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測實驗室生物安全保障基本要求

　　為加強人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測規(guī)范化管理，做好實驗室生物安全管理工作，根據(jù)《病原微生物實驗室生物安全管理條例》(國務(wù)院第424號令，以下簡稱《管理條例》)、《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規(guī)定》(衛(wèi)生部45號令，以下簡稱《管理規(guī)定》)等有關(guān)要求，制定本標準。供醫(yī)院開展人感染H7N9禽流感病毒核酸檢測時參考使用。

　　一、樣本采集

　　(一)進行人感染H7N9禽流感病毒相關(guān)樣本(以下簡稱“樣本”)采集的操作人員必須經(jīng)過生物安全培訓(xùn)合格，并具備相應(yīng)的操作技能。

　　(二)樣本采集過程中，操作人員要加強防護，應(yīng)當穿戴防護服、眼罩、N95及以上水平的醫(yī)用防護口罩、雙層醫(yī)用乳膠手套、帽子等個體防護裝備。

　　(三)用于樣本采集的主容器必須采用優(yōu)質(zhì)塑料材質(zhì)，且大小適合、帶螺旋蓋、內(nèi)有墊圈、無菌、耐冷凍的密閉容器。樣本采集后，主容器蓋必須蓋嚴、擰緊，表面應(yīng)當擦拭消毒。

　　(四)對診療過程中采集的各種臨床樣本，醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)當加強生物安全管理，在進行動態(tài)風(fēng)險溝通與評估基礎(chǔ)上，采取樣本登記造冊、專庫存放、專人負責(zé)以及必要的消毒處理等較嚴格的安全及安保管理措施。

　　(五)樣本采集過程中產(chǎn)生的醫(yī)療廢物要分類收集，應(yīng)當在產(chǎn)生地點進行壓力蒸汽滅菌或可靠的化學(xué)消毒，然后按感染性、損傷性等醫(yī)療廢物收集處置。

　　二、樣本包裝和運輸

　　(一)負責(zé)樣本包裝和運輸?shù)娜藛T應(yīng)當經(jīng)過感染性物質(zhì)包裝、運輸相關(guān)的生物安全培訓(xùn)，并取得相應(yīng)資格。

　　(二)運輸樣本必須采取三層包裝系統(tǒng)，由內(nèi)到外分別為主容器、輔助容器和外包裝。

　　病毒培養(yǎng)物按照A類感染性物質(zhì)進行包裝運輸，其他感染性物質(zhì)按照B類感染性物質(zhì)進行包裝運輸。

　　容器或包裝材料應(yīng)當達到國際民航組織《危險物品航空安全運輸技術(shù)細則》相應(yīng)包裝標準，符合防水、防破損、防外泄、耐高溫、耐高壓的要求。

　　(三)樣本包裝過程中，操作人員要根據(jù)所處環(huán)境條件參照本標準第一條第二款的相關(guān)要求采取加強防護。

　　(四)操作人員應(yīng)當規(guī)范包裝檢測樣本：

　　1.應(yīng)當在實驗室核心操作區(qū)內(nèi)對裝有樣本的主容器外表面進行仔細檢查并擦拭消毒，確保無泄漏、表面無殘留物，并在外表面標明樣本編號、種類、姓名及采樣日期等信息。用足夠的吸收材料包裹主容器，然后放入輔助容器，擰緊(A類)或封嚴(B類)輔助容器，必要時消毒輔助容器外表面。若多個主容器裝入同一個輔助容器時，必須分別包裹，防止彼此接觸，并在多個主容器外面襯以足夠的吸收材料。

　　2.應(yīng)在實驗室清潔區(qū)采用適當?shù)囊r墊材料將輔助容器固定在貼有統(tǒng)一標識的外包裝箱內(nèi)，冰排或制冷器件應(yīng)放在輔助容器和外包裝之間。樣本送檢單、樣本接收證明、準運證書、運送人員資質(zhì)證明、發(fā)送和接收人員信息等相關(guān)文件材料應(yīng)當放入防水的塑料袋中，置于外包裝箱內(nèi)上方。

　　(五)樣本運輸前應(yīng)當聯(lián)系接收機構(gòu)實驗室，告知樣本送檢目的、樣本種類、數(shù)量和預(yù)計送達的時間等。

　　(六)負責(zé)運輸樣本的醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)，應(yīng)當按照《管理規(guī)定》有關(guān)要求，向省級衛(wèi)生行政主管部門或中國疾病預(yù)防控制中心申請辦理《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本準運證書》。在每次運輸結(jié)束后，運輸單位須將運輸情況向省級衛(wèi)生行政主管部門或中國疾病預(yù)防控制中心書面報告。

　　(七)包裝合格的樣本(三層包裝系統(tǒng))可通過航空或陸路運輸。陸路運輸應(yīng)專車運輸，并由2名或以上經(jīng)培訓(xùn)合格的人員護送。運輸途中樣本主容器應(yīng)始終保持直立，運輸車輛內(nèi)應(yīng)攜帶具備清單及有效物品的應(yīng)急處置箱(包)，其中包括個體防護裝備、感染性材料溢灑處置器具、皮膚及創(chuàng)口處置器具、醫(yī)療廢物收集器具以及“生物危險”、“禁止通過”等警示標識。有關(guān)單位或者個人不得通過公共電(汽)車和城市鐵路運輸相關(guān)樣本。

　　三、樣本接收和包裝開啟

　　(一)負責(zé)樣本接收與包裝開啟的操作人員應(yīng)具備相應(yīng)的操作技能，通過生物安全培訓(xùn)并取得相應(yīng)資質(zhì)。

　　(二)樣本包裝的開啟應(yīng)在生物安全二級及以上級別的實驗室進行。樣本送檢單、準運證書、人員上崗證等相關(guān)文件材料的核查、登記，以及相關(guān)風(fēng)險溝通/評估和開具樣本接收證明等工作應(yīng)在實驗室清潔區(qū)內(nèi)進行。

　　(三)包裝開啟過程中，操作者要根據(jù)所處環(huán)境條件參照本標準第一條第二款相關(guān)要求適時加強防護。

　　(四)實驗室操作人員應(yīng)規(guī)范接收檢測樣本、開啟包裝：

　　1.操作人員應(yīng)當在生物安全柜內(nèi)開啟三層包裝系統(tǒng)的第二層輔助容器，并仔細檢查主容器表面有否破損、泄漏或殘留物，發(fā)現(xiàn)異常情況應(yīng)當立即執(zhí)行實驗室應(yīng)急處置程序，同時登記并報告實驗室負責(zé)人。

　　2.操作者應(yīng)當在生物安全柜內(nèi)消毒主容器表面，核對樣本信息，進行下一步的實驗室檢測活動，或轉(zhuǎn)移至指定的保存/保藏地點及位置。

　　(五)包裝開啟和樣本核查結(jié)束后，應(yīng)當在實驗室清潔區(qū)完成交接手續(xù)，開具樣本接收證明，交還外包裝和輔助容器等。實驗室操作人員應(yīng)對所有異常情況進行詳細記錄，運輸和接受樣本的雙方人員簽字確認。

　　四、樣本分裝和檢測

　　(一)負責(zé)樣本分裝、檢測的操作人員應(yīng)當具備人感染H7N9禽流感病毒相應(yīng)的實驗操作能力，經(jīng)過生物安全培訓(xùn)，并取得培訓(xùn)合格資質(zhì)。

　　(二)實驗室用于人感染H7N9禽流感病毒檢測的設(shè)備、設(shè)施必須運行良好，生物安全柜和壓力蒸汽滅菌器應(yīng)當年檢合格。

　　(三)在生物安全二級實驗室從事相關(guān)實驗活動時，操作人員應(yīng)當配戴眼罩、N95及以上水平的醫(yī)學(xué)防護口罩，穿戴防護服、雙層乳膠手套等個體防護裝備。

　　(四)實驗室生物安全等級要求：

　　1.疑似病例未經(jīng)培養(yǎng)的臨床樣本應(yīng)當在生物安全二級實驗室的生物安全柜內(nèi)分裝、滅活和核酸提取。

　　2.人感染H7N9禽流感病毒的分離培養(yǎng)應(yīng)當在生物安全三級實驗室進行。

　　3.動物感染實驗應(yīng)當在動物生物安全三級實驗室進行。

　　(五)開展人感染H7N9禽流感病毒相關(guān)實驗活動時，應(yīng)當有2名以上的操作人員共同進行。

　　(六)實驗過程中產(chǎn)生的醫(yī)療廢物要分類收集，應(yīng)在產(chǎn)生地點進行消毒滅菌，然后按醫(yī)療廢物收集處置。

　　五、樣本保存和銷毀

　　(一)各醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)當將陽性樣本按照要求集中專庫保存。

　　(二)陽性樣本、分離物的保存及銷毀應(yīng)當按照《管理條例》等法規(guī)和規(guī)范性文件有關(guān)要求執(zhí)行。