各省、自治區、直轄市農業、農墾、畜牧、漁業、鄉鎮企業、農機化廳（局、委），新疆生產建設兵團農業局：

　　《高致病性禽流感疫情處置技術規范（試行）》已經2004年2月2日農業部第7次常務會議審議通過，現印發你們，請遵照執行。

　　二00四年二月三日

　　高致病性禽流感疫情處置技術規范（試行）

　　第一項　樣品采集、保存及運輸技術規范

　　采集、保存和運輸樣品應當符合下列要求，并填寫采樣單。

　　一、樣品采集

　　（一）病禽

　　1.至少從5只瀕死禽采集樣品。樣品包括：泄殖腔拭子和氣管拭子（置于緩沖液中）各5個（小珍禽可采集新鮮糞便）；氣管和肺的混樣5個，腸管及內容物的混樣5個；肝、脾、腎和腦等組織樣品（不能混樣）各5個。

　　2.分別采集至少10個病雞的血樣（急性發病期血清）。

　　（二）病死禽

　　無發病禽時，可從死亡不久的病禽采樣，采樣要求同病禽。

　　棉拭子單獨放入容器，容器中盛放含有抗菌素的pH值為7.0－7.4的 PBS液。抗生素的選擇視當地情況而定，組織和氣管拭子懸液中加入青霉素（2000IU/mL）、鏈霉素（2mg/mL）、慶大霉素（50μg/mL）、制霉菌素（10000IU/mL）。但糞便和泄殖腔拭子所用的抗生素濃度應提高5倍。加入抗生素后pH值應調至7.0－7.4.

　　二、樣品保存和運輸

　　血樣要單獨存放，不能混合。

　　樣品應密封于塑料袋或瓶中，置于有制冷劑的容器中運輸，容器必須密封，防止滲漏。

　　樣品若能在24小時內送到實驗室，冷藏運輸。否則，應冷凍運輸。

　　若樣品暫時不用，則應冷凍（最好－70℃或以下）保存。

　　　　　　　　　　　　　　　　采樣單
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┃樣品名稱　　　　│　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　┃
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┃樣品編號　　　　│　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　┃
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┃采樣基數　　　　│　　　　　　　　│采樣數量　　　　│　　　　　　　　　　┃
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┃采樣日期　　　　│　　　　　　　　│保存情況　　　　│冷凍（藏）　　　　　┃
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┃被采樣單位　　　│　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　┃
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┃通訊地址　　　　│　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　┃
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┃聯系電話　　　　│　　　　　　　　│郵編　　　　　　│　　　　　　　　　　┃
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┃　　　　　　　　│　　　　　　　　│　　　　　　　　│　　　　　　　　　　┃
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┃被采樣單位蓋章或簽名　　　　　　　│采樣單位蓋章 采樣人簽名　　　　　　　 ┃
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┃　年　　月　　日　　　　　　　　　│　　　　　　　　　　　　　　　　　　　┃
┃　　　　　　　　　　　　　　　　　│年　　月　　日　　　　　　　　　　　　┃
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┃備注：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　┃
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　　此單一式三份，第一聯存根，第二聯隨樣品，第三聯由被采樣單位保存

　　第二項　血清學診斷技術規范

　　一。 血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗技術

　　（一）材料準備

　　1. 96孔V型微量反應板，微量移液器（配有滴頭）。

　　2. 阿氏（Alsevers）液、雞紅細胞懸液，配制方法見附錄A.

　　3. pH7.2的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS）。

　　4. 高致病性禽流感病毒血凝素分型抗原和標準分型血清以及陰性血清。

　　（二） 操作方法

　　1. 血凝（HA）試驗（微量法）

　　（1）在微量反應板的1－12孔均加入0.025mL PBS，換滴頭。

　　（2）吸取0.025mL抗原加入第l孔，混勻。

　　（3）從第1孔吸取0.025mL抗原加入第2孔，混勻后吸取0.025mL加入第3孔，如此進行對倍稀釋至第11孔，從第11孔吸取0.025mL棄之，換滴頭。

　　（4）每孔再加入0.025mL PBS.

　　（5）每孔均加入0.025mL 1%（V/V）雞紅細胞懸液（將雞紅細胞懸液充分搖勻后加入）。

　　（6）振蕩混勻，在室溫（20℃－25℃）下靜置40min后觀察結果（如果環境溫度太高，可置4℃環境下1hr）。對照孔紅細胞將成明顯的鈕扣狀沉到孔底。

　　（7）結果判定。將板傾斜，觀察紅細胞有無呈淚滴狀流淌。完全血凝（不流淌）的抗原或病毒最高稀釋倍數代表一個血凝單位（HAU）。

　　2. 血凝抑制（HI）試驗（微量法）

　　（1）根據血凝試驗結果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀釋倍數作為終點，終點稀釋倍數除以4即為含4HAU的抗原的稀釋倍數。例如，如果血凝的終點滴度為1：256，則4HAU抗原的稀釋倍數應是1：64（256除以4）。

　　（2）在微量反應板的1－11孔加入0.025mL PBS，第12孔加入0.05mL PBS.

　　（3）吸取0.025mL血清加入第1孔內，充分混勻后吸0.025mL于第2孔，依次對倍稀釋至第10孔，從第10孔吸取0.025mL棄去。

　　（4）1－11孔均加入含4HAU混勻的病毒抗原液0.025mL，室溫（約20℃）靜置至少30min.

　　（5）每孔加入0.025mL的雞紅細胞懸液輕輕混勻，靜置約40min（室溫約20℃，若環境溫度太高可置4℃條件下1hr），對照紅細胞將呈顯鈕扣狀沉于孔底。

　　（三）結果判定

　　以完全抑制4個HAU抗原的血清最高稀釋倍數作為HI滴度。

　　只有陰性對照孔血清滴度不大于21og 2，陽性對照孔血清誤差不超過1個滴度，試驗結果才有效。HI價小于或等于31og2判定HI試驗陰性；HI價等于41og 2為陽性。

　　二、瓊脂凝膠免疫擴散（AGID）試驗

　　（一）材料準備

　　1. 硫柳汞溶液、pH7.2的0.01mol/L PBS溶液，配制方法見附錄B.

　　2. 瓊脂板：制備方法見附錄C.

　　3. 禽流感瓊脂凝膠免疫擴散抗原、標準陰性和陽性血清。

　　（二）操作方法

　　1. 打孔。在制備的瓊脂板上按7孔一組的梅花形打孔（中間1孔，周圍6孔），孔徑約5mm，孔距2mm－5mm，將孔中的瓊脂用8號針頭斜面向上從右側邊緣插入，輕輕向左側方向將瓊脂挑出，勿傷邊緣或使瓊脂層脫離皿底。

　　2. 封底。用酒精燈輕烤平皿底部至瓊脂剛剛要溶化為止，封閉孔的底部，以防側漏。

　　3. 加樣。用微量移液器或帶有6～7號針頭的0.25mL注射器，吸取抗原懸液滴入中間孔（圖1的⑦號），標準陽性血清分別加入外周的①和④孔中，被檢血清按編號順序分別加入另外4個外周孔（圖1的②，③，⑤，⑥號孔）。每孔均以加滿不溢出為度，每加一個樣品應換一個滴頭。

　　4. 作用。加樣完畢后，靜置5min～10min，然后將平皿輕輕倒置放入濕盒內，37℃溫箱中作用，分別在24h、48h和72h觀察并記錄結果。

　　（三）結果判定

　　1. 判定方法。將瓊脂板置日光燈或側強光下觀察，若標準陽性血清（圖1的①和④號孔）與抗原孔之間出現一條清晰的白色沉淀線，則試驗成立。

　　2. 判定標準

　　（1）若被檢血清孔（如圖1中的②號）與中心抗原孔之間出現清晰致密的沉淀線，且該線與抗原與標準陽性血清之間沉淀線的末端相吻合，則被檢血清判為陽性。

　　（2）被檢血清孔（如圖1中的③號）與中心孔之間雖不出現沉淀線，但標準陽性血清孔（如圖1中的④號）的沉淀線一端向被檢血清孔內側彎曲，則此孔的被檢樣品判為弱陽性（凡弱陽性者應重復試驗，仍為弱陽性者，判為陽性）。

　　（3）若被檢血清孔（如圖1中的⑤號）與中心孔之間不出現沉淀線，且標準陽性血清沉淀線直向被檢血清孔，則被檢血清判為陰性。

　　（4）被檢血清孔（如圖1中的⑥號）與中心抗原孔之間沉淀線粗而混濁或標準陽性血清與抗原孔之間的沉淀線交叉并直伸，被檢血清孔為非特異反應，應重做，若仍出現非特異反應則判為陰性。

　　圖1　AGP試驗結果（略）

　　附錄A：HA和HI試驗用溶液的配制

　　1.阿氏（Alsevers）液配制

　　葡萄糖　　　　　　　　　　2.05g

　　檸檬酸鈉　　　　　　　　　0.8g

　　檸檬酸　　　　　　　　　　0.055g

　　氯化鈉　　　　　　　　　　0.42g

　　加蒸餾水至100mL，加熱溶解后調pH值至6.1，69kPa 15min高壓滅菌，4℃保存備用。

　　2.1%雞紅細胞懸液制備

　　采集至少3只SPF公雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用pH7.2的0.01mol/L PBS液洗滌3次，每次均以1000r/min離心10min，洗滌后用PBS配成1%（V/V）紅細胞懸液，4℃保存備用。

　　附錄B：AGP試驗用溶液的配制

　　1.1%硫柳汞溶液的配制

　　硫柳汞　　　　　　　　　　　 1.0g

　　加蒸餾水至　　　　　　　　　 100mL

　　溶解后，置100mL瓶中蓋塞存放備用。

　　2.pH7.2的0.01mol/L PBS 的配制

　　（1）配制25×PB：稱量2.74g磷酸氫二鈉和0.79g二水磷酸二氫鈉加蒸餾水至100mL.

　　（2）配制1×PBS：量取40mL25×PB，加入8.5g氯化鈉，加蒸餾水至1000mL.

　　（3）用氫氧化鈉或鹽酸調pH至7.2.

　　（4）滅菌或過濾。

　　（5）PBS一經使用，于4℃保存不超過3周。

　　附錄C：瓊脂板的制備

　　稱量瓊脂糖1.0g，加入100mL的pH7.2的0.01mol/L PBS液，在水浴中煮沸使之充分融化，加入8g氯化鈉，充分溶解后加入1%硫柳汞溶液1mL，冷至45℃－50℃時，將潔凈干熱滅菌直徑為90mm的平皿置于平臺上，每個平皿加入18mL－20mL，加蓋待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸發，放普通冰箱中保存備用（時間不超過2周）。

　　第三項　高致病性禽流感診斷標準

　　一、診斷指標

　　（一） 臨床診斷指標

　　1.急性發病死亡；

　　2.腳鱗出血；

　　3.雞冠出血或發紺、頭部水腫；

　　4.肌肉和其他組織器官廣泛性嚴重出血。

　　（二）血清學診斷指標

　　1.H5或H7的血凝抑制（HI）效價達到24及以上；

　　2. 禽流感瓊脂免疫擴散（AGP）試驗陽性（水禽除外）。

　　（三）病原學診斷指標

　　1.H5或H7亞型病毒分離陽性；

　　2.H5或H7 特異性分子生物學診斷陽性；

　　3. 任何亞型病毒靜脈內接種致病指數（IVPI）大于1.2.

　　二、結果判定

　　（一）臨床懷疑為高致病性禽流感

　　符合臨床診斷指標1，且至少有臨床診斷指標2、3、4之一。

　　（二）疑似高致病性禽流感

　　符合結果判定（一），且符合血清學診斷指標1或/和2.

　　（三）確診

　　符合結果判定（二），且至少符合病原學診斷指標1、2、3之一。

　　第四項　封鎖技術規范

　　一、由所在地畜牧獸醫行政管理部門劃定疫點、疫區、受威脅區。

　　二、封鎖令的發布：畜牧獸醫行政管理部門報請本級人民政府對疫區實行封鎖，人民政府在接到報告后，應立即做出決定。決定實行封鎖的，發布封鎖令。

　　三、封鎖的實施：當地人民政府組織對疫區實施封鎖。在疫區周圍設置警示標志，在出入疫區的交通路口建立臨時性檢疫消毒站，指派專人，配備消毒設備，禁止易感染活禽進出和易感染禽類產品運出，對出入人員和車輛進行嚴格消毒。

　　四、封鎖令的解除：疫區內所有禽類及其產品按規定處理后，經過21天以上的監測未出現新的傳染源，且受威脅區病原檢測陰性，經動物防疫監督人員審驗合格后，由當地畜牧獸醫行政管理部門向發布封鎖令的人民政府申請解除封鎖。

　　第五項　撲殺技術規范

　　撲殺活禽可采取如下方法：

　　一、窒息

　　先將待撲殺禽裝入袋中，置入密封車或其它密封容器，通入二氧化碳窒息致死；或將禽裝入密封袋中，通入二氧化碳窒息致死。

　　二、扭頸

　　撲殺量較小時采用。根據禽只大小，一只手握住頭部，另一只手握住體部，朝相反方向扭轉拉伸。

　　三、其它

　　也可根據本地情況，采用其它能避免病原擴散的致死方法。

　　第六項　無害化處理技術規范

　　所有病死禽、被撲殺禽及其產品、排泄物以及被污染或可能被污染的墊料、飼料和其他物品應當進行無害化處理。

　　無害化處理可以選擇深埋、焚化、焚燒等方法，飼料、糞便也可以發酵處理。

　　一、深埋

　　1.深埋點應遠離居民區、水源和交通要道，避開公眾視野，清楚標示。

　　2.坑的覆蓋土層厚度應大于1.5米，坑底鋪墊生石灰，覆蓋土以前再撒一層生石灰。坑的位置和類型應有利于防洪。

　　3.禽鳥尸體置于坑中后，澆油焚燒，然后用土覆蓋，與周圍持平。填土不要太實，以免尸腐產氣造成氣泡冒出和液體滲漏。

　　4.飼料、污染物等置于坑中，噴灑消毒劑后掩埋。

　　二、焚化、焚燒

　　1.疫區附近有大型焚尸爐的，可采用焚化的方法。

　　2.處理的尸體和污染物量小的，可以挖1.5米深的坑，澆油焚燒。

　　三、發酵

　　飼料、糞便可在指定地點堆積，密封發酵。

　　以上處理應符合環保要求，所涉及到的運輸、裝卸等環節要避免灑漏，運輸裝卸工具要徹底消毒。

　　第七項　疫區清洗消毒技術規范

　　一、成立清洗消毒隊

　　清洗消毒隊應有一名專業技術人員指導。

　　二、設備和必需品

　　（一）清洗工具：掃帚、叉子、鏟子、鍬和沖洗用水管。

　　（二）消毒工具：噴霧器、火焰噴射槍、消毒車輛、消毒容器等。

　　（三）消毒劑：醛類、氧化劑類、氯制劑類、雙季胺鹽類等合適的消毒劑。

　　（四）防護裝備：防護服、口罩、膠靴、手套、護目鏡等。

　　三、養禽場清理、清洗和消毒

　　（一）首先清理污物、糞便、飼料、墊料等。

　　（二）對地面和各種用具等徹底沖洗，并用水洗刷禽舍、車輛等，對所產生的污水進行無害化處理。

　　（三）養禽場的金屬設施設備的消毒，可采取火焰、薰蒸等方式消毒。

　　（四）養禽場圈舍、場地、車輛等，可采用消毒液噴灑的方式消毒。

　　（五）養禽場的飼料、墊料等作深埋、發酵或焚燒處理。

　　（六）糞便等污物作深埋、堆積密封發酵或焚燒處理。

　　（七）疫點內辦公區、飼養人員的宿舍、公共食堂、道路等場所，要噴灑消毒。

　　（八）污水溝可投放生石灰或漂白粉。

　　四、交通工具清洗消毒

　　（一）出入疫點、疫區的交通要道設立臨時性消毒點，對出入人員、運輸工具及有關物品進行消毒。

　　（二）疫區內所有可能被污染的運載工具應嚴格消毒，車輛的外面、內部及所有角落和縫隙都要用清水沖洗，用消毒劑消毒，不留死角。

　　（三）車輛上的物品也要做好消毒。

　　（四）從車輛上清理下來的垃圾和糞便要作無害化處理。

　　五、家禽市場和籠具的清洗消毒

　　（一）用消毒劑噴灑所有區域。

　　（二）飼料和糞便等要深埋、發酵或焚燒。

　　（三）刮擦和清洗籠具等所有物品，并徹底消毒。所產生的污水要作無害化處理。

　　六、屠宰加工、貯藏等場所的清洗消毒

　　（一）所有家禽及其產品都要深埋或焚燒。

　　（二）禽舍、籠具、過道和舍外區域要清洗，并用消毒劑噴灑。

　　（三）所有設備、桌子、冰箱、地板、墻壁等要沖洗干凈，用消毒劑噴灑消毒。

　　（四）所用衣物用消毒劑浸泡后清洗干凈，其他物品都要用適當的方式進行消毒。

　　（五）以上所產生的污水要作無害化處理。

　　第八項　散養戶養殖場地和禽舍消毒技術要求

　　一、撲殺雞鴨等禽鳥后，場地必須清洗消毒。

　　二、在清洗消毒之前要穿戴好防護衣物。

　　三、禽舍中的糞便應徹底清除，院子里散落的禽糞應當收集，并作堆積密封發酵或焚燒處理。

　　四、清理堆積禽糞時應淋水，不得揚起糞塵。

　　五、用消毒劑徹底消毒場地和禽舍，用過的個人防護物品如手套、塑料袋和口罩等應銷毀。

　　六、可重復使用的物品須用去污劑清洗兩次，確保干凈。

　　七、將撲殺時穿過的衣服用70℃以上的熱水浸泡5分鐘以上，再用肥皂水洗滌，在太陽下晾曬。

　　八、處理污物后要洗手、洗澡。

　　第九項　撲殺禽鳥工作人員防護技術要求

　　一、穿戴合適的防護衣物

　　（一）穿防護服，或者穿長袖手術衣再加一件防水圍裙。

　　（二）戴可消毒的橡膠手套。

　　（三）戴N95口罩或標準手術用口罩。

　　（四）戴護目鏡。

　　（五）穿可消毒的膠靴，或者一次性的鞋套。

　　二、洗手和消毒

　　（一）密切接觸感染禽鳥的人員，要用肥皂洗手。

　　（二）禽鳥撲殺和運送人員在操作完畢后，要用消毒水洗手。

　　三、健康監測

　　（一）所有暴露于感染禽鳥和可疑禽場的人員均應接受衛生部門監測。

　　（二）出現呼吸道感染癥狀的撲殺人員和禽場工人應盡快接受衛生部門檢查。

　　（三）上述人員的家人也應接受健康監測。

　　（四）免疫功能低下、60歲以上和有慢性心臟和肺臟疾病的人員要避免從事與禽接觸的工作。

　　（五）相關人員和獸醫應接受血清學監測。

　　第十項　赴疫區調查采訪人員防護技術要求

　　一、需備物品

　　（一）口罩

　　（二）乳膠手套

　　（三）防護服

　　（四）一次性帽子或頭套

　　（五）膠靴

　　（六）酒精棉球或消毒紙巾

　　（七）處理污染物的大塑料袋

　　二、防護要求

　　（一）要戴口罩，口罩不得交叉使用，用過的口罩不得隨意丟棄。

　　（二）必須穿防護服。

　　（三）進入禽糞污染的地方必須穿膠靴，用后要清洗消毒。

　　（四）脫掉個人防護裝備后要洗手或擦手。

　　（五）若有可能，應當洗浴，尤其是出入有禽糞灰塵的場所。

　　（六）廢棄物要裝入塑料袋內，置于指定地點。

　　第十一項　飼養人員防護技術要求

　　一、飼養人員與染疫禽鳥或糞便等污染物品接觸前，必須戴口罩、手套和護目鏡，穿防護服和膠靴。

　　二、若散養戶飼養人員沒有這些防護裝備，要盡可能變通使用其他物品代替。如用布遮蓋口鼻代替口罩，用塑料袋包頭和腳，可洗滌的東西裹在身上等。

　　三、參與處理禽鳥及相關清洗消毒工作的，應穿戴好防護物品。

　　四、場地清洗消毒完成后，脫掉防護物品要洗手、洗澡。

　　五、衣服須用70℃以上的熱水浸泡5分鐘，再用肥皂水洗滌，于太陽下晾曬。

　　六、銷毀一次性手套、塑料袋和其他相關物品。

　　七、膠靴和護目鏡等要清洗消毒。

　　八、處理完上述物品要洗手。

　　九、兒童不得參與上述工作。