3.試驗項目、試驗原則及結果判定

　　3.1　免疫調節作用

　　3.1.1　試驗項目

　　3.1.1.1　動物試驗

　　3.1.1.1.1　臟器／體重　比值

　　胸腺／體重　比值

　　脾臟／體重　比值

　　3.1.1.1.2　細胞免疫功能測定

　　小鼠脾淋巴細胞轉化試驗

　　遲發型變態反應

　　3.1.1.1.3　體液免疫功能測定

　　抗體生成細胞檢測

　　血清溶血素測定

　　3.1.1.1.4　單核——巨噬細胞功能測定

　　小鼠碳廓清試驗

　　小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗

　　3.1.1.1.5　NK細胞活性測定

　　3.1.1.2　人體試食試驗

　　3.1.1.2.1　細胞免疫功能測定

　　外周血淋巴細胞轉化試驗

　　3.1.1.2.2　體液免疫功能試驗

　　單向免疫擴散法測定IgG、IgA、IgM

　　3.1.1.2.3　非特異性免疫功能測定

　　吞噬與殺菌試驗

　　3.1.1.2.4　NK細胞活性測定

　　3.1.2　試驗原則

　　要求選擇一組能夠全面反映免疫系統各方面功能的試驗，其中體重、臟器／體重比值、細胞免疫、體液免疫和單核——巨噬細胞功能為必測指標。在確保安全的前提下盡可能進行人體試食試驗。

　　3.1.3　結果判定

　　3.1.3.1　在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核——巨噬細胞功能及NK細胞功能檢測中，有兩個以上（含兩個）功能檢測結果陽性，可以判定具有免疫調節作用。

　　3.1.3.2　在細胞免疫功能測定項目中選擇該方面的兩個試驗，且結果均為陽性，可以判定具有細胞免疫調節作用。

　　3.1.3.3　在體液免疫功能測定項目中：①選擇兩個試驗且結果均為陽性②選擇抗體生成細胞試驗，但要求至少兩個劑量組陽性，可以判定具有體液免疫調節作用。

　　3.1.3.4　在單核——巨噬細胞功能測定項目中選擇該方面的兩個試驗，且結果均為陽性，可以判定具有非特異性免疫調節作用。

　　3.1.3.5　對任何一項免疫試驗具有抑制作用可判定該受試物具有免疫抑制效應。

　　3.7　耐缺氧作用

　　3.7.1　試驗項目

　　3.7.1.1　小鼠常壓耐缺氧試驗

　　3.7.1.2　亞硝酸鈉中毒存活試驗

　　3.7.1.3　急性腦缺血性缺氧試驗

　　3.7.2　試驗原則

　　小鼠常壓耐缺氧試驗、亞硝酸鈉中毒存活試驗、急性腦缺血性缺氧試驗三項試驗中任選二項進行

　　3.7.3　結果判定

　　二項試驗結果陽性，可判定有耐缺氧作用。

　　附：耐缺氧作用檢驗方法

　　1.常壓耐缺氧試驗

　　1.1　原理

　　缺氧對機體是一種緊張性刺激，影響機體各種代謝，特別是影響機體的氧化供能，最終會導致機體的心、腦等主要器官缺氧供能不足而死亡。

　　1.2　材料

　　250mL磨口廣口瓶、秒表、凡士林、鈉石灰（或等量氫氧化鈉和碳酸鈣）。

　　1.3　實驗動物

　　推薦使用近交系小鼠。選用6～8周（20±2g）小鼠，雌雄均可，單一性別每組不少于10只。

　　1.4　劑量分組

　　按體重隨機分為1個對照組和3個劑量組（組間差應不大于1g），其中1個劑量應相當于人日公斤體重推薦攝入量的10倍。

　　1.5　實驗方法

　　各劑量組經口連續給予不同濃度受試物20～30天，對照組給予同等容量溶劑，于末次灌胃后1小時，將各組小鼠分別放入盛有15g鈉石灰的250mL磨口廣口瓶內（每瓶1只），用凡士林封瓶口，蓋嚴，使之不漏氣，立即計時，以呼吸停止為指標，觀察小鼠因缺氧而死亡的時間。

　　1.6　統計方法及結果判定

　　采用方差分析處理數據。受試物組與對照組比較，存活時間延長，并具有統計學意義，則判定該試驗結果陽性。

　　1.7　注意事項：

　　1.7.1　每個磨口廣口瓶內最好只放1只小鼠，以防互相干擾影響耐缺氧能力的測定。

　　1.7.2　廣口瓶一定要密閉封嚴，以防漏氣，否則會影響試驗結果。

　　1.7.3　廣口瓶必須等容量（誤差±1ml）。試驗前先用水加以校正。

　　1.7.4　每批實驗動物的體重應盡量保持一致。

　　2.亞硝酸鈉中毒存活試驗

　　2.1　原理

　　亞硝酸鈉使正常二價鐵血紅蛋白轉變為三價鐵血紅蛋白，破壞血紅蛋白攜氧能力，造成組織缺氧死亡。

　　2.2　材料

　　亞硝酸鈉、秒表　1ml注射器

　　2.3　實驗動物

　　選體重20±2g健康小鼠，雌雄均可，單一性別每組不少于10只。

　　2.4　劑量分組

　　同1.4

　　2.5　試驗方法

　　各劑量組經口連續給予不同濃度受試物20～30天，對照組給予同等容量溶劑，于末次灌胃后1小時，各組動物均腹腔注射亞硝酸鈉溶液200～240mg／kg.bw（0.1ml／10g），立即計時，記錄動物存活時間。

　　2.6　統計方法及結果判定

　　采用方差分析處理數據。受試物組與對照組比較，存活時間延長，并具有統計學意義，則判定該試驗結果陽性。

　　3.急性腦缺血性缺氧試驗

　　3.1　原理

　　動物斷頭后，由于腦供血終止，在短時間內腦中原有的血液和營養物質尚能使腦功能維持短暫時間，顯示出有規律地張口喘氣，以喘氣時間為指標，可觀察受試物對腦缺血性缺氧的保護作用，凡能使腦耗氧降低的受試物，均能延長動物喘氣時間。

　　3.2　材料

　　剪刀　秒表

　　3.3　實驗動物

　　同2.3

　　3.4　劑量分組

　　同2.4

　　3.5　實驗方法

　　各劑量組經口連續給予不同濃度受試物20～30天，對照組給予同等容量溶劑，于末次灌胃后1小時，各組動物（在乙醚淺麻醉下）自頸部逐只斷頭，立即按秒表記錄小鼠斷頭后至張口喘氣停止時間。

　　3.6　統計方法及結果判定

　　采用方差分析處理數據。受試物組與對照組比較，喘氣時間延長，并具有統計學意義，則判定該試驗結果陽性。

　　3.7　注意事項

　　3.7.1　斷頭用的大剪刀必須鋒利，斷頭時操作要敏捷，捉拿小鼠不宜反復多次或捉拿時間過長。

　　3.7.2　斷頭部位在小鼠耳根后部，切勿損傷延腦，否則斷頭后小鼠不顯現喘氣活動。

　　4.輔助抑制腫瘤作用

　　4.1　試驗項目

　　4.1.1　動物移植性腫瘤試驗

　　4.1.2　免疫功能試驗

　　NK細胞活性測定

　　單核——巨噬細胞功能測定

　　4.2　試驗原則

　　動物移植性腫瘤試驗必須選擇兩種或兩種以上瘤株，重復一次，同時必做兩項免疫功能試驗。

　　4.3　結果判定

　　兩種或兩種以上瘤株的動物移植性腫瘤試驗，實體瘤瘤重或腹水瘤生存時間，經統計學處理差異有顯著性，實體瘤抑瘤率必須在30％以上（含30％）；本試驗要求重復一次，同時至少有一個相同劑量組在兩次試驗中結果均為陽性，并且對免疫功能無抑制作用者，方可判定該受試物具有輔助抑制腫瘤作用。

　　5.預防化學致癌作用

　　5.1　試驗項目

　　5.1.1　動物誘發性腫瘤試驗

　　5.1.2　免疫功能試驗

　　NK細胞活性測定

　　單核——巨噬細胞功能測定

　　5.2　試驗原則

　　動物誘發性腫瘤試驗，兩項免疫功能試驗必做。

　　5.3　結果判定

　　動物誘發性腫瘤試驗陽性，并且對免疫功能無抑制作用，則可判定該受試物具有預防化學致癌作用。

　　6.調節血脂作用

　　6.1　試驗項目

　　6.1.1　大鼠脂代謝紊亂模型法（預防性高血脂模型法和高血脂模型法）

　　6.1.2　人體試食試驗

　　6.2　試驗原則

　　預防性高血脂模型法和高血脂模型法任選一種，血清總膽固醇、甘油三脂和高密度脂蛋白膽固醇為必測指標。在確保安全的前提下，盡可能進行人體試食試驗。

　　6.3　結果判定

　　6.3.1　動物實驗

　　2項或2項以上指標陽性，可判定有調節血脂作用；血清總膽固醇、甘油三脂兩項指標中一項指標陽性，且2個或2個以上劑量組同時呈陽性，可判定有調節血清總膽固醇或甘油三脂的作用。

　　6.3.2　人體試食試驗

　　人體試食試驗陽性，可判定該受試物對人體具有調節血脂作用。

　　7.改善性功能作用

　　7.1　試驗項目

　　7.1.1　動物實驗

　　7.1.1.1　交配試驗

　　7.1.1.1.1　大鼠交配試驗

　　7.1.1.1.2　小鼠交配試驗

　　7.1.1.2　勃起試驗

　　7.1.2　人體試食試驗

　　7.2　試驗原則

　　動物實驗和人體試食實驗均為必做項目。評價改善性功能作用，應主要觀察是否增強性交功能及陰莖勃起功能。考慮到影響性功能的因素很多，而睪酮對性功能的維持具有重要意義，必要時可對血清睪酮水平進行測定。

　　7.3　結果判定

　　7.3.1　動物實驗

　　交配實驗（大、小鼠交配試驗任選一項）或勃起試驗中有一項試驗結果為陽性，即可判定該受試物具有改善動物性功能的作用。

　　7.3.2　人體試食試驗

　　人體試食試驗陽性，可判定該受試物對人體具有改善性功能作用。